HPTLC 通用混标 (UHM): 高效薄层色谱系统适用性测试 (SST) 新思路

“在 HPTLC 系统中,每张板都代表一个新的分析体系。每次进行分析操作当天,在每个板上都应执行 SST,以验证其是否符合实验条件要求。SST 通常仅适用于包含预设限值在内的单个方法。如果 SST 失败,则样品检测数据无效,无法进行评估。” 

Dr. Tiȇn Do (CAMAG 实验室主管)

在高效薄层色谱 (HPTLC) 中,应用合适的系统适用性测试 (SST) 在每个薄层板上对分析系统进行验证非常重要,是数据有效性的前提,一般是选择几个具有特定分析方法的化学对照物质作为参考。但目前常用的 SST 实验设计具有一定的局限性,列举《美国药典》和《欧洲药典》中关于 SST 的描述内容可见下表:

常用 SST 方法及其局限性

SST 新思路
HPTLC 通用混标

针对上文列出的局限性,UHM 应运而生,可用于在常规分析中验证 HPTLC 结果,实现对 HPTLC 色谱图的整个 RF 范围进行验证。

什么是 UHM ?

UHM, the Universal HPTLC Mix,即高效薄层色谱通用混标,由 8 种不同性质的化合物组成,广泛适用于各种 HPTLC 方法的 SST 测试。

HPTLC 通用混标 (UHM) 的开发

01. 物质的选择
  • 选择的物质最好具有安全、稳定、无需衍生化即可检测、易于获得且价格低廉等特点。据此,实验人员从数以千计的物质列表中,选择了 24 种化合物。

  • 针对这 24 种化合物在 HPTLC 板上的色谱行为进行研究,分别用 20 种不同展开剂进行洗脱,涵盖尽量广泛的极性和选择性,最终从中选择了 8 种化合物:鸟苷、舒利苯酮、胸苷、扑热息痛、邻苯二甲酰亚胺、氢芴、噻吨酮和 2-苯并三唑四甲基丁基苯酚。 

UHM 在不同展开系统下的色谱行为
图为 UHM 在不同展开系统下的色谱行为,在各条件下的选择性均可保证至少 3 - 4 个有效化合物的条带均匀分布在所需评估的范围内
02. 评估响应特性
  • 相对湿度对每种物质的选择性有不同的影响。当板的活性偏离预期的相对湿度 0 – 5%、33%、75% 或 100% 时,UHM 的响应特性可以清楚地检测出这些偏离。

  • 对甲苯-乙酸乙酯 90:10 (V/V) 的展开剂组成施加每种组分溶剂 ±10% 的变化,用 UHM 获得的 HPTLC 指纹图谱有显著反应。

  • 针对相同的展开剂进行不同饱和参数设置的考察(不饱和、部分饱和和充分饱和)。结果表明,部分饱和 RF 值相对增加,而完全饱和 RF 值相对降低,UHM 可以检测饱和操作的一般影响。 

03. 评估 UHM 性能
  • 分别在实验室内和实验室间进行检测,使用 3 种展开剂并得出 ΔRF,评估 UHM 性能。

  • 在实验室内试验中,ΔRF 为 0.029; 实验室间试验为 0.040。

04. 评估不同类型的硅胶薄层板
  • 在色谱系统中薄层板的材料是一个关键参数。由于硅胶的规格不同,例如不同的粘合剂或荧光指示剂的存在,不同的薄层板可能会有不同的选择性。 

  • 使用 UHM 评估了 6 种不同类型的涂敷型硅胶薄层板,使用相同的展开剂,乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水 100:11:11:26 (V/V)。

UHM 在不同类型硅胶薄层板上的选择性评估
UHM 在不同类型硅胶薄层板上的评估
UHM 在不同类型硅胶薄层板上的选择性评估

UHM 与现行 SST 比较

使用 UHM 和现行的 SST 进行精油标准鉴别。

  • 在原有方法中乙酸异丁香酚 [1a] 和异丁香酚 [1b] 被定义为 SST。作为特定标记物,使用的是芳樟醇和乙酸芳樟酯,或冰片和乙酸冰片酯。在这个例子中,还测试了 3 种精油:薄荷油、薰衣草油和肉豆蔻油。

  • 针对 UHM 和当前 SST 的每个成分,计算平均 RF 值及其预测区间。下图数据表明,UHM 成分的预测区间与原始 SST 的预测区间在同一范围内。

UHM 成分的预测区间
UHM 成分
总结
  • HPTLC 通用混标 (UHM) 是当前 SST 的一个很好的替代方法。

  • 8 种不同极性、不同化学类别组分的混合物价格低廉、稳定,对验证色谱系统的变化具有良好的响应性。

  • 与当前的 SST 相比,UHM 的成分显示出与已建立的 SST 的物质和特定标记物具有相似的预测区间。

  • UHM 可以检测展开剂梯度的变化或饱和效应,而许多已建立的 SST 通常只能描述有限的 RF 范围。

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由此可见,高效薄层色谱越来越受实验人员的关注,原因不单在其快速、直观、自由衍生的技术优势,而且适用于复杂成分样品的分离及检测。从以上案例中,通过通用混标的应用,简化 SST 方法开发周期,有效保证 HPTLC 在常规分析检测中的数据重现性、有效性和可靠性。

CAMAG HPTLC PRO 全自动色谱系统实现连续多板之 “点样 – 展开 – 衍生 – 检测 – 分析 – 报告” 操作流程,是新一代的高效薄层色谱的领先技术。

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